CRISPR首次在美用于癌症患者T细胞

CRISPR-Cas9基因编辑提供了强大的工具，可增强人类T细胞抵抗癌症的天然能力。

近日，顶尖学术期刊《科学》（Science）在线发布了一项癌症免疫疗法的临床试验最新进展。其中，研究人员开展了一项首次在人类身上进行的I期临床试验，以测试3名难治性癌症患者中进行CRISPR-Cas9多重编辑以工程改造T细胞的安全性和可行性。

研究人员在T细胞中删除了两个编码内源性T细胞受体（TCR）链的基因TCRα（TRAC）和TCRβ（TRBC），以减少TCR错配并增强合成的癌症特异性TCR转基因的表达（NY-ESO-1）。他们去除编码PD-1（PDCD1）的第3个基因，以提高抗肿瘤免疫力。将工程化的T细胞过继转移到患者体内导致持久移植，并在所有三个基因组位点进行编辑。尽管检测到染色体易位，但频率随时间降低。修饰的T细胞可持续长达9个月，这表明在这些条件下免疫原性极低，证明了CRISPR基因编辑用于癌症免疫疗法的可行性。

这项研究的共同通讯作者之一是癌症免疫疗法知名科学家、CAR-T细胞疗法先驱CarlJune教授。他表示：“首先，我们可以成功地在制备细胞过程中精确地多次编辑，让细胞在人体内的存活时间比过去公布的数据更长。其次，目前为止，这些细胞表现出持续攻击并杀死肿瘤的能力。”

这一结果让基因编辑技术应用于癌症治疗方面展现出了令人期待的潜力，并可能为治疗或消除无数人类遗传疾病提供希望。

基因编辑的目的是以单碱基对的精度改变细胞的DNA。该原理首先在哺乳动物细胞中得到证实，当时它表明稀有切割核酸内切酶的表达可产生双链DNA断裂，可通过同源和非同源重组进行修复。然后开发了多种工程核酸酶以提高效率并实现潜在的治疗应用，包括锌指核酸酶、归巢内切核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶和CRISPR–Cas9（与Cas9内切核酸酶相关的聚类的规则间隔的短回文重复序列）。

使用基因组编辑的第一项人类试验试验是在HIV/AIDS患者中进行的，通过靶向白细胞蛋白CCR5，目的是通过非同源重组使基因突变，从而诱导对HIV感染的抵抗力。原则上，在CRISPR–Cas9中整合多个指导序列可在哺乳动物基因组中的多个位点进行多重基因组工程。

CRISPR促进高效多重基因组编辑的能力极大地扩展了可能的靶向遗传操作的范围，从而实现了新的可能性，例如在单轮诱变中同时删除或插入多个DNA序列。使用CRISPR工程来治疗多种疾病的前景越来越接近现实，例如遗传性血液疾病和失明。

CRISPR-Cas9技术的最新进展还允许在人类T细胞中进行有效的DNA修饰，这对于增强癌症治疗的功效具有广阔的前景。T淋巴细胞是专门的免疫细胞，在很大程度上是现代癌症免疫疗法革命的核心。T细胞受体（TCR）复合物位于T细胞的表面上，并且是通过识别与MHC分子结合的外来抗原/肽来成功启动抗肿瘤反应的关键。

癌症免疫疗法最有前途的领域之一是过继细胞疗法（adoptivecelltherapy）。在这一过程中，患者自身的T细胞经过基因工程改造，可以表达可特异性检测和杀死肿瘤细胞的合成（转基因）TCR。最近的研究表明，对于患有骨髓瘤、黑色素瘤和肉瘤的患者，采用对免疫原性NY-ESO-1肿瘤抗原具有特异性的转基因TCR，这种过继T细胞转移方法的安全性和有希望的疗效。这种方法的局限性在于，转基因TCR已显示与内源TCR的α和β链错配和/或竞争表达。治疗性TCRα和β链与内源性α和β链的配对不当会降低治疗性TCR细胞表面表达，并可能产生自反应性TCR。

过继转移的T细胞的另一个缺点是诱导T细胞功能障碍或衰竭，导致功效降低。具有转基因TCR的PD-1缺陷同种异体小鼠T细胞显示出对同种抗原的增强应答，表明T细胞上的PD-1蛋白在可能是细胞内在的抗原应答中起负调控作用。在患有慢性淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒感染的小鼠中过继转移PD-1缺陷性T细胞可导致细胞毒性增强，后来导致终末分化T细胞的积累增强。PD-1的抗体阻滞或PD-1编码基因（即PDCD1）的破坏/敲低，改良的嵌合抗原受体（CAR）或TCRT细胞介导的体外杀伤肿瘤细胞并增强PD-L1+的清除率体内肿瘤异种移植。

但在T细胞疗法的基础上，CRISPR-Cas9基因编辑技术为增强T细胞的天然抗癌能力进一步提供了强有力的工具。在临床前研究中，研究人员和其他人发现，用CAR转导的CRISPR–Cas9介导的人T细胞中PDCD1的破坏增强了异种移植物中的抗肿瘤功效。特异性针对癌症抗原NY-ESO-1的转基因TCRT细胞与靶向PD-1的单克隆抗体的过继转移增强了小鼠的抗肿瘤功效。因此，他们设计了一项首次在人类中进行的I期人类临床试验，以测试用于合成生物学癌症免疫疗法应用的CRISPR-Cas9基因组多重编辑的安全性和可行性。

在插入TCR之前，研究人员用CRISPR技术敲除了T细胞内的3个基因。其中，两个是T细胞自带的TRAC、TRBC和基因，这样可以避免天然的TCR与基因工程插入的受体产生错误配对或竞争，提高治疗性TCR的作用。

而第3个基因则是PDCD1靶向T细胞，以增加表达NY-ESO-1TCR的工程细胞的安全性。原则上，该策略能够增加外源TCR表达并减少混合异二聚体形成的可能性（即通过分别删除α和βTCR结构域基因TRAC和TRBC），并限制T细胞衰竭的发展。由检查点配体PD-L1和PD-L2触发（即删除PDCD1）。

结果

以前的研究显示，这些细胞在几天内就会失去功能，而现在的结果显示，经过CRISPR编辑的细胞在单次注射后能在相当长的一段时间内保持抗癌功能。

临床方案I期人类试验（ClinicalTrials.govNCT）设计用于评估在CRISPR-Cas9编辑TRAC、TRBC和PDCD1基因座后向患者输注自体NY-ESO-1TCR工程T细胞的安全性和可行性。

在制造过程中，将细胞从癌症患者体内取出，进行工程改造，然后再注入人体。经基因工程改造的T细胞产物被称为“NYCE”（NY-ESO-1转导的CRISPR3X编辑细胞）。在该协议的临床开发过程中，研究人员们选择使用TCR而不是CAR，因为使用TCR时细胞因子释放综合征的发生率普遍较低。

原则上，与先前针对转基因TCR的针对NY-ESO-1的临床试验中观察到的不良事件基线较低水平相比，使用Cas9进行基因编辑是否具有潜在的免疫原性或毒性具有更加区分性的评估。通过慢病毒转导工程化自体T细胞，以表达对HLA-A2*限制性的TCR特异性的NY-ESO-1和LAGE-1中的SLLMWITQC肽。材料和方法部分描述了NYCET细胞的制造过程、载体设计和临床方案，并进行了示意性描述（图S1和S2）。在最初招募的6名患者中，有4名患者成功改造了T细胞，并按照FDA接受的研究性新药（IND）申请（表S1）中的规定进行了详细的释放标准测试。

在4名拥有细胞产品的患者中，1位分配了唯一患者编号（UPN）的患者27经历了快速的临床进展，由于无法满足协议规定的安全标准而不再符合输液条件（请参阅补充材料）。最后，在3名接受CRISPR-Cas9工程改造T细胞输注的患者中，2名患者患有难治性晚期骨髓瘤，1名患者患有难治性转移性肉瘤，他们过去接受过的标准疗法都显示无效（表1）。在第-5至-3天（即在给予CRISPR-Cas9工程T细胞给药之前）对患者进行环磷酰胺和氟达拉滨的淋巴结放化疗，每天每公斤输注1×制造的CRISPR-Cas9工程T细胞协议的0（图S2）。没有向患者施用细胞因子。

也就是说，经过这几重基因编辑的T细胞没有导致治疗相关的严重不良反应，并且显示出了持久的存活和扩增能力。

接受T细胞回输后，在最长达9个月的时间内，患者体内仍可以检测到经过基因编辑的工程化T细胞。并且，当研究人员从患者体内分离出经基因编辑的T细胞，带回实验室测试，发现它们仍有杀死癌细胞的能力。

研究人员们期待，这一项在基因编辑方面的突破性发现，可以为后期研究提供有用的参考，并且有可能将其扩展到癌症治疗的更多方面。

附：

表1患者的人口统计资料和工程T细胞输注的日期

图1CRISPR-Cas9NYCET细胞工程的可行性

（A）CRISPR-Cas9NYCET细胞的示意图。（B）NYCET细胞的大规模扩增。自体T细胞用Cas9蛋白转染，该蛋白与针对TRAC，TRBC（即内源性TCR缺失）和PDCD1（即PD-1缺失）的单个向导RNA（核糖蛋白；RNP复合物）复合，然后用慢病毒载体转导以表达转基因NY-ESO-1癌症特异性TCR。细胞在动态培养中扩增8至12天。在培养的最后一天，收获NYCET细胞并将其冷冻保存在不溶性培养基中。对所有4个受试者（UPN07，UPN27，UPN35和UPN39）绘制了培养过程中富集的T细胞总数。（C）通过流式细胞术确定收获的输液产品中的NY-ESO-1TCR转导效率。对表达活CD3和Vβ8.1或右旋体阳性淋巴细胞的数据进行记录，并进一步对CD4和CD8阳性细胞进行记录。（D）使用基于芯片的数字PCR测量NYCE输液产品中TRAC、TRBC和PDCD1基因破坏的总细胞的频率。所有数据代表至少两个独立的实验。误差棒代表平均值+/-SEM。

图2：CRISPR-Cas9工程改造的T细胞的效力和免疫原性

（A）与工程化表达NY-ESO-1和荧光素酶的HLA-A*阳性Nalm-6肿瘤细胞共培养的NYCET细胞的细胞毒性。包括未经CRISPR-Cas9编辑的NY-ESO-1TCR转导的患者T细胞（NY-ESO-1TCR）和具有TRAC，TRBC和PDCD1的CRISPR-Cas9编辑的未转导T细胞（在此表示为CRISPR），包括对照（n=4个患者T细胞输注产品）。星号表示通过组间配对t检验确定的统计学显着性（*P0.05）。误差标志代表SEM。（B）与抗CD3/CD28抗体包被的珠子或表达NY-ESO-1的Nalm-24共同培养24小时后，患者NYCET细胞输液产品（表示为NYCE）产生的可溶性干扰素-γ水平6个靶细胞。患者NY-ESO-1TCR转导的T细胞（NY-ESO-1TCR）和未转导的，CRISPR-Cas9编辑的T细胞（表示为CRISPR）用作对照。误差线表示SEM。（C）随时间显示了临床规模生产中NYCET细胞输液产品中残留Cas9蛋白的定量。星号表示通过时间点之间的配对t检验确定的统计显着性（*P0.05）。（D）来自基于荧光的间接ELISA筛选的结果，该筛选用于检测三名接受NYCET细胞治疗的患者血清中的Cas9蛋白抗体。每个点代表在输注T细胞之前（由垂直的黑色箭头表示）以及在NYCET细胞转移后的各个时间点在患者血清中检测到的抗Cas9信号的数量。RFU=相对荧光单位。（E）在基线患者白细胞去除术样品中检测到免疫反应性Cas9特异性T细胞。来自2名患者的代表性流式细胞仪图（左图），其中T细胞对Cas9肽刺激产生T型干扰素γ阳性。条形图（右图）显示了来自患者或健康供体对照（n=6）的体内CD4+和CD8+T细胞的频率，这些细胞响应三种不同的Cas9肽池的刺激而分泌干扰素-γ。

图3CRISPR-Cas9工程改造的T细胞在患者体内的持续扩增和持久性

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