脑脊液细胞学MGG染色在隐球菌脑膜炎诊断

《国际神经病学神经外科学杂志》,,40(3):-

樊新红，赵钢，冯国栋，杨毅宁，代文

目的探讨脑脊液细胞学MGG染色在隐球菌脑膜炎诊断中的价值，防止漏诊和误诊。方法：脑脊液常规检查采用涂片墨汁染色、细胞学MGG染色和阿利新兰染色。结果：48例隐脑患者脑脊液常规墨汁染色发现隐球菌33例，MGG染色发现47例，经阿利新兰染色发现48例。结论：MGG染色检查对隐球菌的检出率可达98%，且可在脑脊液细胞学检查时一次完成，无需特殊染色，在一定程度上可减少漏诊、误诊。

[关键词]脑膜炎，隐球菌，MGG,诊断

Abstract

Objective:ToevaluatethediagnosisvalueofcerebrospinalfluidMay-GrunwaldGiemsa(MGG)staininpatientswithcryptococcalmeningitis.Methods:Cerebrospinalfluidsmearsweresubjectedtoinkstain,MGGstainandAlcianbluestain.Results:Among48casesofpatientswithcryptococcalmeningitis,inkstaindetectedthepresenceofcryptococcusin33cerebrospinalfluidsamples,MGGstaindetected47,andAlcianbluestaindetected48.Conclusion:MGGstainincreasesthedetectionrateupto98%inthedetectionofcryptococcus.Thismethodcanbefulfilledinjustoneexaminationofcerebrospinalfluidcytologyandneedsnootherspecialstain,thereforedecreasingthemisseddiagnosisandmisdiagnosisofcryptococcalmeningitistosomeextent,

[Keyword]meningitis,cryptococcal,MGG,diagnosis

新型隐球菌脑膜炎病程长，临床表现、脑脊液常规检查及影像学检查缺乏特异性，临床诊断困难，预后较差，即使是正规的治疗，病死率仍高达20％～30％[1]。因此为临床提供早期的诊断依据是减少漏诊、误诊，改善预后的关键。目前确诊主要依靠脑脊液中病原体检测。本文作者整理了近四年来我院确诊的隐球菌脑膜炎48例，分析脑脊液细胞学MGG染色在其诊断中的价值。

1.资料与方法：

1．1一般资料：本组48例，男29例，女19例，年龄4～83岁．平均43.9±20.3岁，病程4天～天，全部病例均有头痛,21例伴有发热,1例病程中有抽搐发作。体检脑膜刺激征阳性者4例．有局灶脑神经功能缺损者2例，1例为一侧外展神经麻痹．1例同时损害视力和听力，1例为肢体无力，2例患者有意识障碍。所有病例均为我院住院或门诊病人．经脑脊液细胞学MGG染色和阿利新兰染色检查发现新型隐球菌而确诊．其中1例尚合并有隐球菌肺炎，合并乙型病毒性肝炎（HB）1例，合并丙型病毒性肝炎1例，合并获得性免疫缺陷病毒感染（HIV）1例，合并2型糖尿病1例，合并系统性红斑狼疮（SLE）2例，合并结缔组织病2例，同时合并HIV、HB1例，合并甲状腺功能亢进症1例，合并带状疱疹1例，未合并其它免疫功能异常疾患者32例。

1.2方法

1.2.1MGG染色：取脑脊液0.5ml,采用粟式FMU-6玻片离心沉淀法收集细胞，细胞学伊红美蓝姬姆萨(maygrunwaldGiemsa,MGG)染色，在高倍镜下检测，光镜下可直接观察到隐球菌，呈大小不等、相隔距离基本相同的紫蓝色圆形茁体，有的可见圆形小芽孢从茁体长出，中心折光性较强．有的周围可见半弧形荚膜。多数呈簇排列（图1），也有散在单个存在。

1.2.2涂片墨汁染色：取脑脊液3～5ml置于普通试管中,以r/min,离心10分钟后弃去上清液,将沉淀物置于洁净玻片上,用印度墨汁混合后加盖玻片置于低倍镜下，先从边缘开始搜索，可适当调整显微镜的可变光栏，如发现在黑色背景中有带着晕轮的圆形透光且如细胞大小的物质，即转用高倍镜仔细观察其结构，若见菌体周围有宽大透明的荚膜，即为隐球菌。可以在黑色背景上见到透亮的圆形隐球菌,尤如夜晚天空中闪烁的星星。

1.2.3阿利新兰染色：①制片：用移液枪吸0.5ml送检脑脊液使用粟式FMU-6玻片离心沉淀法收集细胞。②染色液配制：阿利新兰lg，3％醋酸ml。③染色方法：滴染(10min)，流水冲洗，自然晾干。高倍镜下观察，染色后隐球菌的荚膜被染成深蓝色，菌体呈淡蓝色，而周围的炎性细胞不着色。

1.3　统计学处理　所得数据经SPSS10.0软件进行统计学处理，计数资料采用卡方检验，检验水准取a=0.05,P0.05为差异具有统计学意义。

2结　果

2.1脑脊液常规及生化

首次腰穿24例病人腰穿时脑脊液压力均不同程度升高．其中6例腰穿时脑脊液测压大于mmH2O。脑脊液外观：无色透明．白细胞计数均有不同程度的增高，平均为(.20±.80)×/L。首次脑脊液的生化结果显示（均数±标准差)：蛋白质为0.93±0.66g／L，高于正常值（0．15～0.45g／L）者共l0倒，最高者为2.4g／L；糖1.46士0.81mmol／L,低于正常值(2.5～4.4mmol／l)者共12倒，最低者为0.1mmol／L；氯化物.96土16.28mmol／L，低于正常值(～)者共11例。

2.2脑脊液细胞学

本组48例病人脑脊液细胞学取CSF标本0.5m1，均采用粟式FMMU-6玻片离心沉淀法收集细胞，迈一格一姬(May-Grunwald—Giemsa．MGG)法染色，结合常规细胞计数，总结各病例首次脑脊液病检结果：细胞学分类均呈混合细胞反应，淋巴细胞、激活型淋巴细胞、单核细胞及激活型单核细胞、嗜中性粒细胞各占一定比例．有时可见浆细胞及吞噬细胞，偶见嗜酸性粒细胞。其中30例呈淋巴细胞为主的混合细胞反应,小淋巴细胞加激活型淋巴细胞所占比例大于50%，最高达95.5%；5倒呈嗜中性粒细胞为主的混合反应，嗜中性粒细胞所占比例大于50%．最高达81%；其余13例呈混合型，但单个核细胞均多于多个核细胞。

2.3隐球菌检测

所有48份脑脊液均用上述三种方法检测新型隐球菌。结果如表1所示。

表1MGG细胞学染色法及涂片墨汁染色法对隐球菌的检测结果：

MGG细胞学墨汁染色法合计

染色法检查+-

+

-

合计

P0.

表2治疗前后三种方法隐球菌的检出率(%)

样本数（n=90）

阿利新兰染色墨汁染色MGG染色

治疗前（n=48）

治疗后（n=42）

(48)69(33)98(47)

(42)40(17)78(32)

表3：三种检测方法的灵敏度

标本数

灵敏度

墨汁染色MGG染色阿利新兰染色

患者数（n=48）68.8(33)97.9(47)(48)

标本数（n=90）55.6(50)87.8(79)(90)

共收集来自48例患者的90份脑脊液标本。90份标本中，墨汁染色阳性50例（50/90；55.6%）,阿利新兰染色阳性90例（90/90；%），MGG染色阳性79例（79/90；87.8%）。相对于阿利新兰染色，墨汁染色的灵敏度为68.8%（95%可信区间为50.23-60.97%）（n=50/90）；相对于阿利新兰染色，MGG染色的灵敏度为87.8%（95%可信区间为87.57-88.03%）（n=79/90）。三种方法的特异度为：%（n=90/90）。

48例患者中，相对于阿利新兰染色，墨汁染色的灵敏度为68.8%（95%可信区间为67.92-69.68%）（n=33/48）；相对于阿利新兰染色，MGG染色的灵敏度为97.9%（95%可信性区间为97.82-97.98%）（n=47/48）。三种方法的特异度均为%（n=48/48）。数据表明，MGG染色诊断隐脑的灵敏度高于墨汁染色。

治疗前，墨汁染色对隐球菌的检出率为69%（95%可信区间为68.13-69.87%）（n=33/48）；细胞学MGG染色对隐球菌的检出率为98%（95%可信区间为97.92-98.08%）（n=47/48）。治疗后，墨汁染色对隐球菌的检出率为40%（95%可信区间为38.88-42.13%）（n=17/42）；细胞学MGG染色对隐球菌的检出率为78%（95%可信区间为77.2-78.8%）（n=32/42）。数据表明，治疗前后细胞学MGG染色对隐球菌检出率均较墨汁染色高。

3.讨论

新型隐球菌性脑膜炎(cryptococcusmeningitis，CM)是一种严重危害人类健康的深部真菌病。新型隐球菌的主要致病因子有荚膜和酚氧化酶。由于中枢神经系统封闭性高,机体免疫不易起作用;代谢旺盛,葡萄糖含量低,可刺激酚氧化酶活性。同时有大量儿茶酚胺可作为酚氧化的底物,因此新型隐球菌对中枢神经系统有高亲和性,隐球菌性脑膜炎临床表现多变，脑脊液常规检查和头颅影像学检查缺乏特异性，容易漏诊或误诊为结核性脑膜炎[2]。脑脊液涂片墨汁染色查见或培养分离出隐球菌是隐球菌性脑膜炎诊断金标准，且墨汁染色操作简单迅速，隐球菌和背景差别较大，易于观察，特异性高，医院推广[3]。但由于隐球菌性脑膜炎脑脊液内菌量差异较大检出率低，文献报道新型隐球菌性脑膜炎脑脊液隐球菌检出率第1次为66%第2次17.8%，其余需要3～2O次涂片才能发现阳性[4]。由于隐球菌性脑膜炎脑脊液细胞学和生化检查缺乏特异性，而单次墨汁染色阳性率太低，因此发展新型快速的隐球菌检测方法对提高隐球菌性脑膜炎诊断效率极为重要[5]。

近年来，有多种血清学、免疫学以及PCR方法被用来诊断隐球菌性脑膜炎，但这些方法均费时费力，花费较高，不适合基层使用；且这些方法虽然敏感度较高，但是由于无法直接对隐球菌进行观察，因此无法排除假阳性的情况[6.7]。脑脊液细胞学MGG染色是细胞学检查的常规手段，是一种简单易行的病理检查方法，MGG染色的隐球菌在光镜下有其独特的形态学特点，隐球菌呈团簇状分布，且能观察到典型的荚膜和毛刺结构，具有和脑脊液内免疫细胞迥然不同的结构，因此易于观察和分辨[8],本组病例中47例MGG首次染色即为阳性，阳性率为98%,与上述结果相符，说明如有条件行此项检查是防止误诊的有效手段。对于初期及治疗后期隐脑患者，脑脊液中隐球菌数量少，且多数隐球菌荚膜缺陷，墨汁染色不能检出，玻片离心沉淀法MGG染色却可以使极少量的隐球菌得到富集，极大提高了检出水平，对患者的早期治疗及维持期用药提供实验室证据[9]。此外细胞学检查除检出隐球菌外，还可以看到单核吞噬细胞吞噬隐球菌，这对了解药物疗效起着重要参考作用。且标本存放时间较长，便于长期观察，治疗前后进行对照。但当隐球菌散在出现时易与脑脊液中的小淋巴细胞相混淆。对检验人员的技术水平要求较高，而阿利新兰染色能很好发现隐球菌，由于隐球菌荚膜内含有大量的酸性粘多糖，可被阿利新兰染液着色，所以阿立新兰染色对于隐球菌是特染，染色对比清晰，同时对其它炎细胞不表达，特异性高。本组资料阿立新兰染色检出隐球菌的阳性率高于涂片墨汁染色(%)，与文献报道相符。在细胞学MGG染色不能确定时可选择阿利新兰染色进一步验证。

由此可见，脑脊液细胞学MGG染色检查检出隐球菌较传统的墨汁染色法阳性检出率更高，更直接，在细胞学检查时一步完成，无需特殊染色，是一种首选的快捷便利的方法，因此对疑似新型隐球菌脑膜炎的病例除常规进行脑脊液涂片墨汁染色外，应将脑脊液MGG染色细胞学检查列为又一常规检查，由于新型隐球菌经MGG染色后有时不易与脑脊液中的细胞相鉴别,早期会忽视，因此，对同一标本可在MGG染色的基础上再行印度墨汁染色及阿利新兰染色予以确认。提高隐球菌的检出率，避免误诊或漏诊。

[1]BicanicT,HarrisonTS.Cryptococcalmeningitis．BritishMedicalBulletin;72:99–

[2]TaylorWR,NguyenK,NguyenD,etal.,ThespectrumofcentralnervoussysteminfectionsinanadultreferralhospitalinHanoi,Vietnam.

[3]SatishchandraP,MathewT,GadreG,etal.Cryptococcalmeningitis:clinical,diagnosticandtherapeuticoverviews．NeurolIndia[J].;55(3):-32．

[4]PerfectJR,DismukesWE,DromerF,etal.．Clinicalpracticeguidelinesforthemanagementofcryptococcaldisease:updatebytheinfectiousdiseasessocietyofamerica.ClinInfectDi[J].;50(3):-.．

[5]SatoY,OsabeS,KunoH,etal.Rapiddiagnosisofcryptococcalmeningitisbymicroscopicexaminationofcentrifugedcerebrospinalfluidsediment.[J].;(1):72-5.

[6]PatelS,ShinGY,WijewardanaI,etal..TheprevalenceofcryptococcalantigenemiainnewlydiagnosedHIVpatientsinaSouthwestLondoncohort.[J].JInfect.;66(1):75-9.

[7]SahaDC,XessI,JainN.Evaluationofconventionalserologicalmethodsforrapiddiagnosisofcryptococcosis.IndianJMedRes[J].;(5):-8.

[8]AdamP,SobekO,DolezilD,etal.Cryptococcalmeningitis--afollow-upstudyofaseriousclinicalentity:quickcytologicalandmicrobiologicaldiagnosticsusingaspecialstainingprocedureincerebrospinalfluidspecimens.FoliaMicrobiol(Praha).;54(6):-8.

[9]SugiuraY,HommaM,YamamotoT.Difficultyindiagnosingchronicmeningitiscausedbycapsule-deficientCryptococcusneoformans.JNeurolNeurosurgPsychiatry[J]..2;76(10):-1