直播精选结核病实验室诊断常用方法与新

　原创作者：医院（医院）余方友文字编辑：医院张秋莹

新冠疫情的来势凶猛让全世界不寒而栗，新冠就像是突如其来闯入大众视野的超强飓风，结核病就像大众“最熟悉的陌生人”，而它发病人数之多、影响范围之广、破坏程度之深相比新冠更甚，是难以消散的雾霾！随着国家十三五结核病防治规划出台，新型结核病服务体系要求所有地市级定点医疗机构具备开展药敏试验、菌种鉴定和结核病分子生物学诊断的能力，县级定点医疗机构具备痰涂片和痰培养检测能力。这对于新涉足医院实验室，从布局改造到开展新项目无疑都是一种挑战。对于既熟悉又陌生的结核病，有太多的疑问和困惑，今天我们跟随余方友教授学习《结核病实验室诊断常用方法与新技术的应用前景》，将各技术及优缺点为您娓娓道来，答疑解惑。

结核病是个古老的疾病，是全球前10位死因之一的公共健康问题。WHO每年都会公布结核病报告，全球新发患者数量一年就能突破万。说到结核分枝杆菌，我们首先想到的是抗酸染色，也是读书时熟悉的抗酸杆菌。其实临床病原菌的结核杆菌，指的是一个复合群。

●一．概念●

结核分枝杆菌复合群主要包括结核分枝杆菌（M.tuberculosis），牛分枝杆菌（M.bovis），非洲分枝杆菌（M.africanum），卡内蒂枝杆菌（M.canetti）和田鼠分枝杆菌（M.microti）等

●二．特性●

革兰阳性菌，但很难被染色，有些甚至不能被染色，细胞壁含60%脂质，一般用萋尼（Ziehl-Neelsen）抗酸染色法；棒状，无运动能力，专性需氧；生长缓慢，每16-20小时分裂一代，需4-6周才能长成菌落。

●三．诊断●

对于结核病的诊断，有些检查特异性不高。如果找到细菌，才是铁证如山。常规的实验室指标是什么呢？就是做涂片，培养，做药敏，可能也不做药敏。

医院检验科的检测流程图如下：

●四．实验室技术●

下面我们重点讲下实验室的检测技术，常用技术列表总结如下：

结核分枝杆菌菌种鉴定常用技术与新技术

常用技术

优点

缺点

抗酸染色

简便、快速、价廉、可长期保存

阳性率低，特异性差，无法区分MTB/NTM，无法区分死菌与活菌，可能引起实验室污染

荧光染色

简单、快速、低倍镜看视野更多，阳性率高

假阳性率较高，保存时间短，需购置荧光显微镜

自动染片机和显微扫描仪

节省人力，方便阅片

标本孔位不足，不适用大批量标本，假阳性高

固体培养

准确、灵敏度略高于涂片法；可以鉴别死菌与活菌；可进一步进行菌种鉴定和药敏试验

培养周期长，有一定的污染率

，需要人工肉眼观察，工作强度大

液体培养

缩短了培养周期，提高了阳性率

污染率高

免疫层析法（MPT-64）

快速，几分钟出结果，操作简单，成本低，对阳性样本检出率良好

只能鉴定结核分枝杆菌，只能检测固体或液体培养基中的阳性标本，不能直接检测临床标本

质谱技术

鉴定到复合群准确性高，也可鉴定到种

有生物安全问题

双色荧光原位杂交测定法（FISH）

敏感性和特异性高

文献提及，临床应用不多

化学发光法（脂阿拉伯甘露聚糖）

敏感性和特异性高

文献提及，临床应用不多

分子生物学方法检测因为1-2个小时就能出结果越来越受欢迎，它在临床微生物学的应用领域主要是：第一，慢生长或不生长的少见菌；第二，疑难不易辨认的细菌；第三，无菌部位如血液、脑脊液等标本检测。优点是出结果快速，缺点是因靶标不同灵敏度各异。另外结核病免疫学诊断常用方法与新技术也是重要的临床辅助诊断，但单一免疫学检查结果不能确诊，其他技术列表总结如下：

技术

种类

技术名称

特点

分子生物学方法检测

实时荧光定量PCR检测DNA

（IS、HSP65、rpoB等）

无法区分活菌死菌，有实验室污染

半巢式全自动实时荧光定量PCR检测（XpertMTB/RIF）

操作简单、出结果快速、内设质控、WHO推荐方法，仅检测MTB的存在及利福平耐药，多无物价

环介导等温扩增法(LAMP）

适合于基层，人工判读设备要求低

恒温扩增技术检测结核杆菌RNA

针对活菌，污染降低

交叉引物扩增技术（CPA）

无需昂贵仪器，无耐药检测

线性探针技术

人工判读或专用设备，WHO推荐

通用PCR+扩增后分析（探针杂交；熔解曲线；测序；基因芯片等）

可直接检测涂片阳性的痰标本

TB-SAT

灵敏度高，活菌检测，区分MTB/NTM

CRISPR-MTB测试

灵敏度高，样本量少，TAT短

mNGS

用于结核性脑膜炎检测，很少用于常规结核分枝杆菌的检测

药敏常用方法及新技术

液体培养和固体培养

（比例稀释法）

金标准，灵敏度和特异性高，耗时长，操作繁琐

MIC药敏检测

稀释板的效期和工艺具挑战性

蛋白质谱检测MBT-ASTRA

准确性高，没有时间优势

核酸质谱检测

敏感性和特异性尚可

XpertMTB

敏感性不如MIC法

全基因组（WGS）测序

灵敏度和特异性高

单细胞拉曼技术检测

用于药敏试验效果较好

免疫学诊断常用方法与新技术

结核抗体检测（IgG）

灵敏度偏低

结核多抗体检测（结核蛋白芯片法）

敏感性和特异性有提高

结核菌素皮肤试验（TST试验）

简单易行，价格低，受NTM和BCG影响，免疫缺陷病人检出率低

γ-干扰素释放试验（IGRAs）：包括QuantiFERON-TB和T-SPOT

不受NTM和BCG的影响，不能区分活动性和非活动性结核，不能区分近期还是远期感染

●五．总结●

总结一：

当前结核病实验诊断主要难点

1.潜伏感染与活动性感染难以区别

2.难以预测哪些潜伏感染患者在将来会发展为活动性感染

3.治疗效果的监测困难

总结二：

常用方法

1.美国CDC指南建议，对没有确诊的具有临床症状的结核病可疑患者，每个患者至少一份呼吸道标本应采用分子诊断技术进行检测。

2.免疫学检测可作为结核病的辅助诊断手段。

3.结核杆菌培养仍然是诊断结核病所必需的，药敏试验所必需，且为金标准方法。

总结三：

新技术

1.各种快速结核分枝杆菌菌种鉴定和分子药敏方法发展迅速，临床应用前景广阔。

2.免疫学检测方法在区别潜伏感染与活动性感染方面取得一定的进展，值得期待

3.转录组学、蛋白组学及代谢组学是有前途的诊断手段，但仍需进一步研究数据支撑。

4.在预测哪些人群将来发展为活动性结核病的诊断方法方面取得重要进展，令人鼓舞。

审核：鲁炳怀

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