综述胸腔积液miRNA检测用于结核性

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文章来源：中华结核和呼吸杂志,,43(08):-

DOI：10./cma.j.cn--

作者：董静贾红彦潘丽萍张宗德

单位：首都医科医院耐药结核病研究北京市重点实验室北京市结核病胸部肿瘤研究所

摘要

结核性胸膜炎诊断主要依靠细菌学、病理学、分子生物学、细胞免疫学及综合性诊断策略来实现，且与恶性胸膜疾病及其他感染性胸膜疾病鉴别诊断困难。胸腔积液中存在着丰富的蛋白质、非编码RNA及代谢产物，能够反映宿主疾病病理进程和免疫状态，在胸腔积液中寻找能够指示结核性胸膜炎疾病进程和免疫状态的分子标志物已经成为研究的热点。微小RNA由于在各种临床样本中稳定性极高，能够快速准确地定量，使其有望成为一种非侵袭性的生物标志物来追踪疾病的发生、发展及预后，目前在良恶性胸腔积液鉴别诊断方面有一定的价值。本文将综述胸腔积液miRNA检测用于结核性胸膜炎诊断的现状及问题，为开发结核性胸膜炎诊断新技术提供理论基础。

多种疾病可以引起胸腔积液的异常积聚，包括结核性胸膜炎、恶性胸膜疾病及肺炎等。在结核病高负担国家，由结核性胸膜炎和恶性胸膜疾病引发的胸腔积液最为常见[1,2,3]。目前，结核性胸膜炎的诊断主要依靠病史、临床表现、影像学、胸腔积液常规检查和疗效观察，确诊率较低，特别是与恶性胸腔积液鉴别诊断困难[4]，因此需要开发敏感度和特异度较高、操作性强的诊断方法，用以实现结核性胸膜炎的快速诊断。

miRNA不仅存在于细胞中，还存在于各种体液中，参与包括传染性疾病在内的多种疾病的病理生理过程[5,6]。miRNA稳定性好、抗酸碱、抗酶降解、抗反复冻融和其他极端条件，是一种对疾病诊断、治疗和预后监测有重要意义的生物标志物[7]。已有多项研究探讨并肯定了胸腔积液miRNA检测用于各类肺癌诊断的价值，提示胸腔积液miRNA检测的可行性和重要意义[8,9,10]。

一、胸腔积液miRNA定量检测方法

miRNA定量检测主要依靠芯片、二代测序、qPCR及数字PCR。前两者是高通量检测方法，适合于miRNA标志物的初步筛选[11]。数字PCR技术刚刚起步，在miRNA定量检测方面的研究较少，因其敏感度较高，主要应用于外泌体miRNA的检测[12,13]。目前大多数研究均依靠qPCR技术完成对胸腔积液中miRNA的定量检测。与细胞内miRNA检测类似，也分为探针法和引物法，两种方式各有千秋。但目前商业化的探针或引物并不能满足所有miRNA检测的需要，研究者尚需要根据靶标不同进行设计。目前胸腔积液或其他体液中miRNA的定量检测并没有确定的内参基因，但有3种选择：（1）沿用已经在细胞中证实可用的内参基因，如U6；（2）在前期高通量芯片或测序结果中筛选样本间稳定表达的miRNA作为内参；（3）RNA提取时定量引入外参miRNA，如Cel-miR-39。这3种方法在既往研究中均有应用，但目前尚不能确定哪一种方法更准确和可靠[14,15]。在胸腔积液miRNA检测中，如果有条件，应使用至少2种以上内参进行检测，综合评价定量效果。

二、胸腔积液miRNA检测用于结核性胸膜炎诊断的研究现状

1．胸腔积液miRNA诊断结核性胸膜炎：目前针对结核性胸腔积液与其他类型胸腔积液，应用miRNA定量检测进行鉴别诊断的研究相对较少，大部分数据来源于恶性胸腔积液特异性miRNA的研究，其中多将结核性胸腔积液与其他类胸腔积液合并为良性胸腔积液，与恶性胸腔积液进行鉴别诊断。Han等[16]发现miR-在肺癌胸腔积液中的表达量显著低于结核性胸腔积液和肺炎旁胸腔积液，与癌胚抗原（carcinoembryonicantigen,CEA）和细胞角蛋白19的片段（cytokeratin19fragmentantigen,Cyfra21-1）联合后效果更好。文献报道恶性胸腔积液中miR-、miR-和miR-22表达明显低[17]，单个miRNA鉴别诊断良恶性胸腔积液的受试者工作特征曲线下面积（areaundercurve,AUC）高于0.70，联合CEA蛋白鉴别诊断良恶性胸腔积液的AUC可达到0.94。焦昕和刘宁[18]发现结核性胸膜炎患者胸腔积液和血清中miR-29a和miR-的表达显著高于恶性胸膜疾病患者，而且在抗结核治疗后表达下调，提示临床上定量检测血及胸腔积液中miR-29a和miR-水平，可能有助于鉴别诊断结核性胸腔积液和恶性胸腔积液，而且这2个miRNA用于鉴别活动性肺结核的敏感度和特异度也较好[19,20,21]。来自不同体液和细胞的研究结果提示，miR-29和miR-可作为结核性胸膜炎诊断的潜在标志物。各项研究中发现的miRNA种类不同，可能与各研究纳入的组别不同有关。2．胸腔积液外泌体中miRNA检测诊断结核性胸膜炎：与健康对照组比较，疾病组可提取出的外泌体更多，且成分也有差异[22,23,24]。有研究纳入了肺腺癌、结核性胸膜炎及其他良性胸腔积液患者，以胸腔积液外泌体为研究对象，应用二代测序发现个差异miRNA，其中结核性胸腔积液和恶性胸腔积液中共发现22个表达量相对较高的差异miRNA，进一步验证后可能会发现对区分结核性胸腔积液和恶性胸腔积液具有潜在价值的miRNA[25]。在另外一项研究中，结核性胸腔积液和肺炎胸腔积液间存在3个差异miRNA，而在结核性胸腔积液和癌性胸腔积液间存在32个差异miRNA，其中miR-i和miR-在结核性胸腔积液和其他2个对照组中均存在显著差异，有可能是结核性胸腔积液的特异性miRNA[26]。外泌体可通过物理阻隔以及与Ago2相结合，避免RNA酶消化，提高RNA分子的稳定性[27]，因此，外泌体内含有的miRNA作为疾病诊断的标志物用于鉴别胸腔积液的性质可能具有一定的优势。但因外泌体分离、纯化和鉴定步骤的复杂性以及微量miRNA定量检测的困难，可能会给外泌体miRNA标志物的应用带来一些阻碍，但相信随着技术的进步，未来应用外泌体miRNA检测用于疾病的诊断仍然具有前景。3．胸腔积液细胞中miRNA检测诊断结核性胸膜炎：胸腔积液中存在着大量的细胞，其中单核细胞在结核性胸膜炎疾病进展中发挥重要作用。分析胸腔积液单核细胞中miRNA的表达谱，可能获得与结核性胸膜炎疾病进展相关的特异性miRNA。袁荣霞等[28]用qPCR的方法检测了65例恶性胸腔积液和61例良性胸腔积液（包括39例结核性胸膜炎）中miRNA的表达，发现miR-29c在良性胸腔积液中含量更高，而miR-21和miR-含量较低，认为这3个miRNA有可能成为临床鉴别诊断良恶性胸腔积液的标志物。Spinelli等[29]分别在结核性胸膜炎和对照组患者的外周血单个核细胞（PBMC）和胸腔积液单个核细胞（PFMC）中分析了miRNA的表达情况，发现miR-a在同一患者PBMC和PFMC中均出现差异表达，但在PFMC中显示差异表达的miR-、miR-*和miR-却在PBMC中无差异表达，说明结核性胸膜炎患者PFMC和PBMC中的miRNA表达谱有相似之处，但并不一致，这可能与PFMC来自病灶部位，可以更直观地反映病灶部位的病理进展和免疫状态有关，而外周血miRNA表达谱受到更复杂的机体相互作用的限制，可能会掩盖结核性胸膜炎疾病进程的特异性miRNA的表达。因此，在病灶部位直接相关的胸腔积液中寻找结核性胸膜炎特异性miRNA，可能更有助于疾病的诊断[30,31]。

三、胸腔积液miRNA检测用于结核性胸膜炎诊断所面临的挑战

随着疾病诊断标志物研究的不断深入，越来越多的研究者意识到单一标志物诊断的局限性[32]，多靶标的联合应用可提高疾病的诊断效能，但这种联合大多是基于各类数学模型，如logistic回归、贝叶斯分类、决策树等[33,34]。目前已有研究应用logistic回归模型对多个miRNA或其他蛋白进行联合检测，用于良恶性胸腔积液的鉴别诊断[35]。多靶标联合诊断可有效提高诊断效能，但这需要更准确的特异性miRNA的鉴定以及基于数学模型的不断优化。目前尚无确定的、商业化的miRNA组合用于临床诊断，可能与胸腔积液中miRNA含量低、定量检测技术待优化以及尚无研究开展基于大样本的筛选和验证导致样本覆盖程度不足等原因有关。相对于细胞或组织而言，依靠现有技术鉴定获得的胸腔积液miRNA种类相对较少，表达量也相对较低，给胸腔积液特异性miRNA的筛选和鉴定带来了一定的困难[7]。但随着二代测序技术的发展甚至是三代测序技术的应用，胸腔积液miRNA的测序深度会越来越高；敏感度更高的数字PCR的应用也将极大提高胸腔积液miRNA的检出率；目前已有公司研发的miRNA预扩增试剂盒可以实现对低表达量miRNA的检测[33]。相信随着这些技术的不断进步，胸腔积液miRNA定量检测方法将会越来越简化。此外，对于现已筛选获得的特异性miRNA在结核性胸膜炎发生和发展中的作用机制仍然未知。因此，尚需要设计大样本量的横向和纵向研究阐明miRNA在疾病中的调节机制和作用，以确保特异性miRNA在临床结核性胸膜炎鉴别诊断中的可靠性和实用性。尽管胸腔积液miRNA检测仍然面临一些问题和难题，但随着液体活检越来越受到

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