专题笔谈结核病诊断新技术及其评价

　

专题笔谈·中国结核病诊治进展

结核病诊断新技术及其评价

卢水华1，肖和平2

1.上海公共卫生临床中心

复旦大学附属公共卫生临床中心结核科

2.同济大医院

结核病临床研究中心

上海市结核(肺)重点实验室

中国实用内科杂志，，35（8）：-

关键词:

结核病；诊断技术

Keywords:

tuberculosis；diagnosis

作者简介卢水华，主任医师、教授、复旦大学及温州医科大学研究生导师。上海公共卫生临床中心复旦大学附属公共卫生临床中心结核科主任，H7N9应急病房主任，复旦大学附属上海市公共卫生临床中心药物临床试验质量管理机构结核病专业组负责人。兼任中华医学会结核病学分会常务委员及临床学组组长，中国防痨协会儿童结核病学组组长，上海市结核病专科分会副主任委员，上海市TB/HIV双重感染技术专家组成员。多家期刊编委、副主编。近年来主持和参与省部级以上课题10余项，在国内外各级杂志发表论文60余篇(SCI15篇，IF)，主编及编写教材、专著余万字。

早期准确诊断是结核病(TB)患者得以及时治疗的关键，提高诊断技术则是发现患者的核心[1]。然而，目前的TB诊断水平仍然薄弱。据世界卫生组织(WHO)估算，年的万新发TB患者中，仅登记了万，还有.5万(25.3%)未被发现(漏诊)[2]。我国年新登记的肺结核患者中，按25%漏诊率，估计漏诊患者28万，其中漏诊传染性患者11万[3]。这些数据表明，当前在TB患者发现策略及诊断技术方面存在不足。TB的诊断一直以来存在诸多困难，本文将着重从微生物检测、生化检测、免疫学检测、分子生物学检测等方面介绍TB诊断方面的进展及其评价。

1

微生物学检测

根据年WHO统计，仅有58%的TB患者有病原学依据，病原学检测是诊断TB最重要的依据，包括涂片染色镜检、结核分枝杆菌(MTB)分离培养、MTB药敏和菌种鉴定等[1]。

染色涂片法是临床上最便捷快速的诊断方法，但敏感度偏低，发达国家可检出50%的活动性肺结核，我国检出率一般约为30%，且无法区别非MTB。MTB分离培养是确诊TB最重要的依据，不仅能取得病原学结果，还能进一步进行药敏检测，指导治疗。目前常用的细菌培养基包括Lowenstein-Jensen固相培养基(L-J法)和Middlebrook7H97H11液体培养基。固相培养基价格低，但耗时长，需要4~8周取得结果，加上菌种鉴定的时间耗时更长。基于BACTECMGIT、BacT/Alert3D系统的液体培养基检测速度有明显提高(1~4周)，但费用较高。

1.1MTB快速培养法

BACTECMGIT系统采用荧光增强原理，在培养管底部包埋对氧气浓度高度敏感的指示剂，通过检测氧气浓度变化以监测培养管内MTB的生长状态。阳性标本检出时间相对较短，平均为9d，后续菌种鉴定及药敏试验时间平均为4d。BACTECMGIT系统为目前国际通行培养标准，培养阳性率较固体培养法高出10%左右，检测界限10个菌落形成单位(CFU)/mL。BacT/Alert3D系统采用比色法原理，通过监测预处理标本中产生CO2与标本瓶中初始的CO2相比较，判断是否存在MTB生长。同时可以进行药敏检测。理论上培养速度较L-J法和BACTECMGIT系统更快(6~22d)。

1.2直接显微镜检技术(MODS)

工作原理依据于MTB在液体培养基中生长会出现特征性的索状结构，该结构可以通过倒置显微镜观察到。Arias等[4]对例的份呼吸道标本的研究显示，MODS检测呼吸道标本中是否存在MTB的敏感度为97.5%，特异度为94.4%，出现阳性结果的中位时间约为8d该方法无需昂贵的设备，简单，相对快速。

2

生化检测

TB的生化检测主要包括腺苷脱氨酶(ADA)、乳酸脱氢酶(LDH)、血管紧张素转化酶(ACE)等酶学检测。此类方法简单快速，适用于TB早期诊断及鉴别诊断，但由于缺少结核特异性的酶标而无确诊价值。

2.1ADA

ADA是嘌呤核苷代谢中重要的酶。胸(腹)腔积液ADA检测对结核性胸(腹)膜炎鉴别诊断有重要意义，胸(腹)腔积液ADA浓度以45U/L为界，结核性大多超过此值，特异度及敏感度超过80%。胸(腹)腔积液ADA与血清ADA比值≥1更倾向结核性积液。而对于癌性及非特异性积液，其比值一般1。

Riquelme等[5]进行的一项包括了例腹膜炎病例(包括50例结核性腹膜炎)的Meta分析表明，阈值浓度为39U/L时，ADA对于活动性TB的敏感度为%，特异度为97%。脑脊液中ADA活性检测对于TB的诊断也有一定价值，尤其应用于结核性脑膜炎与隐球菌脑膜炎、病毒性脑膜炎的鉴别。结核性脑膜炎脑脊液中ADA活性增高，通常8U/L，而后两者一般正常，ADA浓度≤8U/L。Tuon等[6]综合了13项研究的Meta分析(总计例结核性脑膜炎)表明，将ADA浓度8U/L作为结核性脑膜炎诊断的阈值时，其诊断的总敏感度59%，特异度96%。

2.2LDH

是一种糖酵解酶，几乎存在于机体所有组织细胞的胞质内。对TB的诊断来说，LDH可用于区别渗出性积液与漏出性积液，胸(腹)腔积液LDH与血清LDH比值≥0.6，LDH浓度U/L倾向渗出液。结核性胸(腹)腔积液的LDH浓度一般U/L，与癌性胸(腹)腔积液LDH浓度变化无特征性差异。

2.3ACE

为二肽羧肽水解酶，又名激肽酶I，存在于肺、肾、脑、小肠、胎盘等组织的血管内皮细胞或上皮细胞及血浆。对TB的诊断来说，血清ACE的检测主要用于TB与结节病的鉴别，后者血清ACE浓度升高多见。结核性胸腔积液ACE浓度一般不升高，胸腔积液ACE与血清ACE比值≥1更倾向结核性积液，而恶性积液的比值多1。

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细胞免疫学检测

MTB为胞内致病菌，因此普遍认为TB的发病过程中细胞免疫占主导地位。细胞免疫学诊断主要包括结核菌素皮肤试验(tuberculinskintest，TST)和γ-干扰素释放试验(interferongammareleaseassay，IGRA)，而结合上述两种方法优点的改良结核菌素皮肤试验近年来发展很快。

3.1TST

即PPD皮试或皮内Mantoux试验。TST从年发明以来沿用至今。由于TST存在假阳性结果和假阳性结果，影响了其使用价值。假阳性结果大部分是由于结核菌素抗原与其他分枝杆菌有交叉抗原所致。这种交叉抗原反应来自潜在的非MTB感染或接种卡介苗引起的反应。假阴性结果有很多潜在的原因，迟发超敏反应低下常见于免疫受损者，包括人免疫缺陷病毒(HIV)感染，长期使用激素等情况。阴性结果不能排除MTB感染。由于不同地区的感染背景差异较大以及没有潜伏性结核感染(LTBI)的检测金标准，导致TST的敏感度和特异度不能准确评价。

3.2血清学检测

WHO和不少国家推荐使用IGRA进行MTB感染的血清学检测，这类试验采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和(或)酶联免疫斑点法(ELISPOT)定量检测全血和(或)外周血单核细胞在MTB特异性抗原刺激下释放γ-干扰素的水平，用于诊断LTBI及辅助诊断TB。目前利用IGRA原理，有2种较为成熟的试剂盒，即QuantiFERONTBGOLDInTube试剂盒(QFT-GIT，CellestisIncorporated，Carnegie，Australia)和T-SPOT.TB试剂盒(OxfordImmunotec，Abingdon，UK)，先后被美国食品药品监督管理局(FDA)批准应用于临床[7]。检测结果阳性可被判断为MTB感染。IGRA在24h之内就可以获得结果，花费的时间比TST短，并且不会因为复强效应(Booster效应)受到影响，可反复进行，医院里，该试验的操作和管理比TST更便捷，不需要专门的医生多次观察结果。同TST一样，这种方法无法区分LTBI与活动性肺结核，因此，不能单独作为TB的确诊依据[8-9]。

目前该检测成本偏高，不适用于人群筛查。试验结果在一定程度上受到T细胞水平及活性的影响，对于免疫抑制或者免疫缺陷者可能会结果不准确。虽然有资料表明对于HIV感染、血液病、恶性肿瘤、矽肺以及慢性肾衰者，预防性治疗TB潜伏感染的常用方法是IGRA，但对于其中严重的免疫抑制者，IGRA的诊断价值会降低。对于中国人群来说，IGRA并不能显示出明显超过TST的优势[10-11]。

4

分子生物学检测

MTB核酸扩增检测(NAA)是近年来TB诊断领域中最有突破的，检测手段日趋成熟。部分新型的核酸检测技术(如分子线性探针检测)得到了WHO的认可和推荐，可用于TB的诊断和耐药检测。理论上NAA敏感性很好，即使标本中只有极低拷贝数的细菌也能检出，一般24h之内即可取得检验结果，并且在生物安全级别上要求相对较低，还可以通过检测异烟肼和利福平的常见耐药基因位点，从而筛查出耐药MTB。

4.1标准聚合酶链式反应(PCR)

是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等几步反应组成1个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可以通过核酸扩增检测MTB的存在，同时可以对特定基因位点检测来判断菌株的耐药性。理论上PCR对于存在细菌的标本都有较好的检出率，但实际临床上应用可能存在一定的偏差。假阳性结果主要由靶序列或扩增产物的交叉污染所致，假阴性结果的出现主要是影响Taq酶活性，包括以下2个方面：

一是临床标本中可能存在内源性抑制因子(5%~20%)，如DNA样品中的蛋白质和重金属离子；二是标本溶血、血红蛋白残留、处理过程中使用苯酚等物质。

4.2改进的核酸检测技术

传统PCR检测总的敏感性尚不理想，同时可能存在污染、操作失当等因素的影响，因此随后产生了多种改进手段，包括整合的MTB核酸扩增检测试剂盒以及全自动化MTB检测系统。前者包括如GenProbeMTB核酸直接扩增检测(GenProbeamplifiedMTBdirecttest，AMTD；SanDiego，CA，USA)、罗氏AmplicorMTB检测(RocheamplicorMTBtest，Basel，Switzerland)、BD-ProbeTecSDAtest(BectonDickinson，MD，USA)，实时荧光核酸恒温扩增检测技术(simultaneousamplificationandtesting，SAT；仁度生物，中国)等商业试剂盒；后者主要指GeneXpertMTB/RIF系统(Cepheid，USA)。其中由于WHO的推荐，GeneXpertMTB/RIF已在全球60多个国家使用，下文分别予以介绍。

4.2.1GenProbeMTB核酸直接扩增检测恒温扩增16SrRNA，以MTB复合群特异性探针检测扩增产物，采用转录介导的扩增技术对靶核酸进行扩增，采用化学发光物哑啶酯标记的DNA探针与扩增的靶基因进行杂交，探针与扩增产物交叉后利用杂交保护试验去除未杂交的标记探针，最后利用化学发光仪检测发光信号，可在2h内做出诊断。据报道，该方法的特异度95%，对痰细菌培养阳性肺结核敏感度为92%~%，对于痰细菌培养阴性肺结核敏

感度为40%~93%，对于肺外结核敏感度约为93%。

4.2.2罗氏AmplicorMTB检测扩增引物16SrRNA基因片段，然后于各种分枝杆菌菌种特异性的寡核苷酸探针进行反向斑点杂交或微孔板反向杂交鉴定菌群，部分研究表明，该方法总的特异度95%，对于痰细菌培养阳性肺结核检出97%，对痰细菌培养阴性肺结核敏感度为40%~73%，对肺外结核敏感度为77%~98%。

4.2.3BD-ProbeTecSDAtest半定量的链置换扩增技术，以IS和16SrRNA为靶序列，经加热变性后与特异性引物杂交，在DNA聚合酶的作用下产生带限制性核酸内切酶识别位点的靶DNA序列，然后核酸内切酶在其识别位点将DNA双链打开缺口，DNA聚合酶继之延伸缺口3’端并替换下一条DNA链。被替换下来的DNA单链可以与引物结合并被DNA聚合酶延伸成双链。该过程不断反复，使靶序列高效扩增。该方法总的特异性90%，对于痰细菌培养阳性肺结核检出达90%~%，对于痰细菌培养阴性肺结核敏感度33%~%，对于肺外结核敏感度为76%。

4.2.4实时荧光核酸恒温扩增检测技术在同一温度下，首先通过M-MLV反转录酶产生靶标核酸的1个双链DNA拷贝，然后利用T7RNA多聚酶从该DNA拷贝上产生多个(~0)RNA拷贝；每个RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环；同时，带有荧光标记的探针和这些RNA拷贝特异结合，产生荧光。该荧光信号可由荧光检测仪器实时捕获，直观反映扩增循环情况。本试剂盒通过检测RNA来证实MTB的存在，扩增效率极高，15~30min即可将模板扩增倍，理论上检测灵敏度和准确性远高于其他核酸检测技术；该技术采用实时荧光闭管检测，使污染得到有效控制；即使污染产生，由于扩增产物为RNA，环境中极易降解，从而大幅度提高检测结果的可靠性。目前该试剂盒已获批准于我国应用。

4.2.5GeneXpertMTB/RIF系统GeneXpertMTB/RIF检测试剂盒为美国Cepheid公司开发的，适用于GeneXpert仪器，可在2h内直接从患者新鲜痰液或冻存痰液中检测是否还有MTB及对利福平的耐药情况，整个过程都在一密闭环境中进行，该方法采用全自动实时荧光定量PCR原理，将样品处理、核酸扩增、目标序列的实时检测整合于一体，通过对MTB特有的序列rpoB基因上于利福平耐药相关81bp的核心区域(RRDR)进行检查。

Boehme等[12]在《新英格兰医学杂志》发表报道，对4个TB高负担国家的例疑似TB患者进行诊断评估，对于细菌培养阳性、涂片阳性的标本检测时，MTB/RIF的检出率为98.2%(/)；对于培养阳性、涂片阴性的标本检测时，MTB/RIF的一次检出率为72.5%(/)，该检测方法特异度达99.2%(/)。与药敏实验相比，MTB/RIF检测方法对利福平耐药患者的检出率高达97.6%(/)，对利福平敏感患者的检出率达98.1%(/)。Boehme等[13]对南非、秘鲁、印度、阿塞拜疆、菲律宾和乌干达的例可能携带MTB、耐多药MTB的疑似患者进行检测，MTB/RIF也取得类似结果。

GeneXpertMTB/RIF系统极大的改进了我们对TB分子生物学诊断的看法，该系统高度全自动化，生物安全性好，速度快，对于TB的诊断是一大贡献。但是该系统仍有未克服的缺陷：对于肺外结核、痰细菌培养阴性结核的检出率不高，尤其是对于菌量极少的标本；对于中国人群来说，利福平耐药是否真能预测大部分异烟肼耐药尚不能确定；此外，检测费用高也是限制其推广的重要原因。

5

结语

TB诊断技术近年来取得了很大进展，将为提高TB的诊断水平发挥重要作用。对于我国来说，一方面需要探索合理使用上述方法的策略，一方面更应该创新性研究适合我国的新方法和新工具，为早期准确诊断TB做贡献。

参考文献略。

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