年病原宏基因组文章盘点二

年病原宏基因组文章盘点

微生物是目前发现的所有生物中最不可控的“活性暗物质”。微生物群既是独立的个体，同时也是我们身体的一部分，在生理、生态及时间空间维度上影响着我们的生活状态。因此，理解微生物与宿主之间的相互作用至关重要，目前大量研究聚焦微生物，期望可以了解并利用这些因素预防和治疗“现代化”疾病。

01

论文ID

原名：AssessmentoftheClinicalUtilityofPlasmaMetagenomicNext-GenerationSequencinginaPediatricHospitalPopulation

文章类型：回顾性研究

期刊：JournalofClinicalMicrobiologyIF:4.

通讯作者：RoseLee

通讯作者单位：医院

主要内容

研究背景

mNGS已应用于各种临床样本：脑脊液、血液、呼吸道、胃肠液和眼部液体等。与很多分子诊断感染性疾病检测不同，mNGS“无需先验性假设”，可一次性诊断多重感染并对检测到的核酸进行定量。mNGS的局限性在于检测到的微生物无法直接判断是否是致病菌以及结果判读的复杂性。

前期临床医生推测血浆mNGS可能在以下临床场景中具有应用潜力：

1)由于抗生素的预处理或感染的是苛养微生物而导致培养阴性的感染。

2)深部感染和难以取样的感染，如侵袭性真菌感染、肺炎或骨髓炎。

本次研究客观评估了血浆宏基因组测序临床性能和实用性。

研究方案

入组样本来源

回顾了2年在儿科机构接受检测的54名患者，以评估所鉴定生物的临床相关性及其对抗菌素管理的影响。

评估所需参数

患者基本信息、潜在并发症、感染部位、检测前使用抗菌药物的时间、最终临床诊断结果、mNGS检测结果、是否免疫受损等。

评估标准

综合参考标准是临床医生如何判读检测结果以及针对检测结果作出临床治疗调整的依据，作者认为这是对“感染”最有临床意义的定义(表1)。真阳性的确认由两名儿科专家的意见确定(足够权威)，若两人意见不一致，由第三人仲裁。对mNGS的检测结果采用两种方法进行评估，分别为血浆检测次数和检测微生物数。

表1A：临床相关性(真阳性)和临床不相关性(假阳性/阴性)判定

方案

研究结果

1.54名患者进行了59次血浆mNGS检测。29次检到的微生物物种≥1。其中，55％的微生物与临床相关，14%的mNGS检测结果对临床治疗有积极意义。潜在的免疫缺陷和整体免疫受损状态是唯一显著影响mNGS价值的因素。

2.方法1(n=59)检测血浆mNGS的阳性符合率为53%，阴性符合率为79%，mNGS真阳性72%，mNGS真阴性50%。

3.方法2(n=81)，单独分析所有鉴定出的微生物，PPA和NPA分别为46%、75%，所有mNGS阳性中真阳性的比例为55%。

4.评估了每微升血浆中微生物cfDNA分子(MPM)与临床相关微生物的关系。临床相关微生物MPM中位数为，与临床无关的生物MPM中位数，但有无使用抗菌药物微生物的MPM无显著性差异。通过ROC曲线及Youden指数判定是MPM是最佳临界值，其敏感性为74%，特异性73%。

讨论与结论

1.此次血浆mNGS检测性能远低于其他临床验证性研究的结果。作者推测，检测效能的差异在一定程度上反映了mNGS应用方式的差异。

2.这项研究是首次在效能验证时将多菌种鉴定纳入评估，并且单独评估了每种微生物的真阳性，这对mNGS阳性结果中的真阳性比例有很大影响(每项测试评估为72%，而每一种微生物评估为55%)。

3.该研究中的许多患者最终被诊断为非感染性疾病，或者在缺乏微生物学数据的情况下进行了推定的感染治疗，与以前的研究相比，这产生了更高的假阳性和阴性。

4.本研究独特地定义了可能与血浆mNGS检测效能相关的其他临床因素，包括疾病进程的天数、检测前抗菌治疗持续时间和MPM等。并发现MPM和真阳性之间存在显著的关联，表明高MPM应该使临床更有信心相信结果是有意义的。

5.在这项临床实践中，mNGS阴性的样本中真正阴性的比例仅为50％。

6.研究发现免疫受损患者的效用更高，而心内膜炎的价值却低于预期。

7.这项研究存在一定局限性：样本量相对较小，每个相关诊断亚类(例如培养阴性心内膜炎)的患者数量较少；mNGS没有参考标准。这项研究虽然获得了血浆mNGS检测性能和实用性的一些数据，但还需要进一步的工作来了解如何将mNGS更好的应用到传染病诊断工作中。

02

论文ID

原名：Clinicalapplicationandevaluationofmetagenomicnext-generationsequencinginsuspectedadultcentralnervoussysteminfection

文章类型：前瞻性单中心研究

期刊：JournalofTranslationalMedicineIF:4.

通讯作者：张文宏

通讯作者单位：医院

主要内容

研究背景

及时准确鉴定病原对中枢神经系统感染的诊治至关重要。传统脑脊液培养可鉴别出30–40％的中枢神经系统感染。根据最新调查，在发展中国家培养检出率在5.4–24.3％之间，阳性率低；组织活检、X-pert、LAMP和FilmArray可以在一定程度上提高诊断能力，但这些方法具有侵入性或只可检测有限微生物及依赖预判的缺点。迄今为止，已有研究指出mNGS在检出病原体、缩短经验性治疗时间等方面的价值。然而，先前大多数的研究集中于新发和罕见病原体感染的临床病例上。本次研究前瞻性重点比较了mNGS与传统方法在成人CNS感染中的诊断价值及可优化的方向。

研究方案

入组样本来源

纳入年2月15日至年2月5医院位疑似CNS感染的患者，在无对照组的情况下进行单中心前瞻性研究。

评估所需参数

患者基本信息(体温、身体指标)、最终临床诊断结果、mNGS检测结果、脑脊液样本基本信息(白细胞、蛋白质、葡萄糖)、脑影像学结果、脑脊液病原微生物培养结果、FilmArray脑膜炎/脑炎panelPCR结果、特异性抗体检测结果、病理检查结果。

评估标准

A：疑似CNS感染的判断标准

中枢神经系统感染的症状和体征包括：发热(38℃)、头痛、脑膜炎征候、呕吐、抽搐、局灶性神经功能缺损、意识改变或嗜睡。至少应满足下列条件之一：a脑脊液中白细胞数量增加、蛋白质升高和/或葡萄糖水平降低；b脑影像学检查提示病理性感染的改变。

B：中枢神经系统感染最终诊断标准

中枢神经系统感染：符合临床标准，病原学标准;非中枢神经系统感染：不符合临床标准。

1）临床标准：中枢神经系统感染的症状和体征包括以下一项或多项：发热(38℃)、头痛、脑膜体征、呕吐、抽搐、局灶性神经功能缺损、意识改变或嗜睡。且至少应满足以下条件之一：

a.脑脊液中白细胞数量增加、蛋白质升高和/或葡萄糖水平降低。

b.脑影像学提示病理性感染的改变。

c.经有效治疗后痊愈。

2）病原学标准：至少满足下列方法之一

a.脑脊液病原微生物培养阳性。

b.FilmArray脑膜炎/脑炎panelPCR、特异性抗体检测(诊断性单抗体滴度(IgM)或配对血清(IgG)4倍增强)或病理检查呈特异性阳性。

研究结果

在例入组的患者中，排除失访的6例和病因不明的12例。将例样本分为两组，即CNS感染(例)和非CNS感染(71例)。所有入组样本均进行mNGS和培养，并根据临床需要对33例患者进行了其它病原检测，获得19例阳性。最终的CNS感染包括95例细菌感染、38例真菌感染、3例寄生虫感染、10例病毒感染、4例混合感染和9例未分类感染。非CNS感染包括自身免疫性脑炎、恶性肿瘤等。

a:mNGS检测表明：细菌是最常见的潜在致病菌；排名前三的是肺克、结核和鲍曼；检出最多的真菌是隐球菌。

b:在怀疑CNS感染及其细菌亚组中，与mNGS阴性/病例一致和mNGS阴性/病例不一致的组相比，mNGS阳性/病例一致的组的CSF白细胞和蛋白质水平显著升高，而CSF/血清葡萄糖比率较低。进一步评估脑脊液实验室检查对mNGS检出率的影响表明，在CNS感染中，脑脊液白细胞*/L，脑脊液蛋白mg/L或葡萄糖比≤0.3的患者，mNGS检出率显著升高。在细菌亚组中，脑脊液白细胞*/L和葡萄糖比≤0.3与较高的mNGS检出率相关。

在本研究中，培养结果19例阳性。mNGS在培养阴性患者样本中额外检出48种细菌和真菌；在其它常规方法报告阴性样本中，mNGS额外检出5种潜在致病微生物(结核分枝杆菌、白色念珠菌和大肠杆菌等)。

在经验性治疗的CNS感染患者中，mNGS检出率均显著高于传统培养(34.45%vs7.56%)和常规方法(34.45%vs18.49%)。经验性治疗降低了培养和常规方法的检出率(25.00%vs7.65%,40.00%vs18.49%)，不影响mNGS的检出率。

对于采样前给予有效抗生素治疗超过4天的患者，mNGS的检出率却显著降低，说明病原检出率受采样时间的影响。

对于无论是否接受过经验性治疗的患者样本，mNGS检出率均明显高于常规方法。mNGS的特异性低于传统培养和常规方法(98.59vs%)；mNGS在接受和未接受经验性治疗的患者的灵敏度为66.67%(6/9)和90.00%(9/10)。

在CNS感染患者中，mNGS与传统方法(含培养)的阴阳性一致率分别为69.11%和75.00%。在非CNS感染患者中，mNGS与传统方法(含培养)的一致率为98.59%。

在所有入组的例患者中，61例患者mNGS结果归为mNGS阳性/病例一致，70例患者mNGS结果归为mNGS阴性/病例一致。

mNGS半定量测序reads与CSF中WBC和葡萄糖比率水平相关。在所有病例中，当患者接受有效的抗菌药物治疗后，mNGS测序reads在数周内下降至负值。

总结与结论

本研究将mNGS、培养及其它常规方法的结果与临床最终诊断进行比较分析，评估了这些方法的诊断性能。研究表明：mNGS对于潜在致病微生物的检出率优于传统方法(50%vs42.5%)；经验性抗生素的使用使传统方法的检出率降低约20％，而mNGS的检出率未受影响。但如果有效抗菌治疗后的延迟采样超过4天，会显著降低mNGS检出率；mNGS在经验性治疗组和非经验性治疗组的敏感度为66.67%和90%。当传统检测方法结果为阴性时，mNGS可额外检出病原，将两种方法相互补充，可以提高病原诊断能力；实验室检查结果如CSF/WBC和蛋白质水平的升高或葡萄糖比率降低均与CNS感染患者中mNGS阳性的升高有一定的相关性，mNGS对于这类CNS患者的诊断价值可能更加明显；此外，mNGS的半定量价值还体现在动态监测病原菌负载和疾病进展。总结与讨论

03

论文ID

原名：MetagenomicNext-GenerationSequencingforDiagnosisofInfectiousEncephalitisandMeningitis:ALarge,ProspectiveCaseSeriesofPatients

文章类型：前瞻性多中心研究

期刊：FrontiersinCellularandInfectionMicrobiologyIF:3.

通讯作者：张家堂

通讯作者单位：医院第一医学中心神经内科

主要内容

研究背景

传染性脑炎和脑膜炎是严重的临床疾病，在全球范围内发病率和死亡率很高。鉴定感染体的过程因脑脊液体积有限，血脑屏障，传统检测手段的限制导致超过50%的患者呈现阴性。目前有一些研究使用mNGS诊断中枢神经系统疾病，但大多数研究引入的样本量较小，并侧重于特定病毒、细菌、真菌或原核生物，结果表明mNGS的阳性预测值较高。有一些规模稍大的研究发现，mNGS确实改善了神经系统感染的诊断，但阳性率并不高。因此，本次设计的课题即mNGS在感染性脑炎和脑膜炎诊断中的表现的研究采用更大的样本量，从而补充了mNGS应用在临床上价值性的参考数据。

研究方案

入组样本来源

年11月至年5月收集了北京市6医院诊断为传染性脑炎和/或脑膜的患者名，最终名接受治疗的患者入选。

评估所需参数

患者基本信息、临床诊断结果、mNGS结果、其它病原微生物检测结果(x-pert/涂片/培养/抗原检测)，所有患者均接受了至少3个月的随访。

评估标准

纳入标准：对中枢神经系统感染性疾病高水平临床怀疑；未感染患者腰椎穿刺。

排除标准：拒绝腰椎穿刺；任何此类穿刺的禁忌症；自身免疫性脑炎的诊断。

最终诊断分为五组：病毒性脑炎和/或脑膜炎、结核性脑膜炎、细菌性脑膜炎、真菌性脑膜炎和中枢神经系统非感染组。

研究结果

共有名患者最终入组，其中75名患者患有假定的病毒性脑炎和/或脑膜炎，44名患者患有假定的TBM，43名患者患有假定的细菌性脑膜炎，18名患者患有真菌性脑膜炎，33名患者患有假定的非感染性中枢神经系统疾病。非传染性中枢神经系统疾病包括脑膜癌(6/33，18%)、与结缔组织疾病相关的脑病(6/33，18.18%)、代谢性脑病(5/33，15.15%)和其他非传染性疾病(16/33，48.48%)。例确诊中枢神经系统感染的mNGS阳性检出率为57.0%。

mNGS在病毒性脑炎和/或脑膜炎诊断中的应用

75例病毒性脑炎和(或)脑膜炎(54例明确，21例可能)的患者。在种特异性读数(SSRN)≥2时，mNGS诊断病毒性脑炎和/或脑膜炎的表现最佳([AUC]=0.，95%[CI]=0.-0.)；阳性、阴性和总符合率分别为42.6、89.1和76.0%。

mNGS在TBM诊断中的应用

44例患者被诊断为TBM(6例明确，38例可能)。在属特异性读数≥1时，mNGS诊断结核性脑膜炎(明确或可能)的表现最佳(AUC=0.，95%[CI]=0.-0.)，阳性率为27.3%。

mNGS在细菌性脑膜炎诊断中的应用

43例被诊断为细菌性脑膜炎(15例明确，28例可能)的患者，当SSRN≥5或10被认为是阳性时，AUC值(0.，95%[CI]=0.-0.)最大。mNGS诊断的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为73.3%、95.9%、61.1%和97.6%。

mNGS在真菌性脑膜炎诊断中的应用

在13例隐球菌感染性脑膜炎患者中，脑脊液墨汁染色和真菌培养的首次阳性率分别为0和38.4％。经过多次染色/培养后，上述两种方法的阳性率为84.62％。在所有(12/12)CSF样本中均检测到隐球菌抗原。当SSRN≥2，mNGS的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为76.92％(10/13)、99.52％(1/)、90.91％(10/11)和98.56(/)。

在5例确诊的脑曲霉病患者中，当SSRN≥2时，mNGS的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为80％(4/5)、79.3％(/)、8.5％(4/47)和99.40(/)。

讨论与结论

本文探讨了mNGS与常规微生物检测相比是否有助于感染性脑炎和脑膜炎的诊断的问题。研究发现：由于病原基因组序列和生存方式不同，不同的中枢神经系统感染与不同的阳性诊断标准相关。与传统方法相比，mNGS更有效地检测中枢神经系统感染，mNGS与常规微生物检测相结合可提高CNS感染的检测水平。全文分析了mNGS对四种常见形式的传染性脑炎和/或脑膜炎的诊断价值，这是本文的优势，并非集中所有的中枢神经系统感染患者。本研究的局限性包括：首先，RNA-Seq数据没有与DNA测序同时进行；此外，由于DNA提取效率对mNGS结果至关重要，因此在未来的研究中必须对各种试剂盒的提取效率进行比较。最后，文章样本量相对较小，特别是根据感染类型对患者进行分组后。

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论文ID

英文标题：RetrospectiveValidationofaMetagenomicSequencingProtocolforCombinedDetectionofRNAandDNAVirusesUsingRespiratorySamplesfromPediatricPatients

文章类型：临床研究

期刊名：TheJournalofMolecularDiagnosticsIF：5.

通讯作者：SandervanBoheemen

通讯单位:荷兰莱顿大学医学中心

主要内容

研究背景

mNGS测序技术的无偏倚检测可以覆盖所有潜在的病原体，但目前应用到病毒上的研究方案仍然存在很高的挑战。为了将mNGS应用于病毒诊断，需要同时对RNA和DNA病毒进行灵敏度检测。

研究方案

SandervanBoheemen团队同时对临床样本进行DNA和RNA病毒检测。设计和优化了mNGS实验方案和生物信息学分析流程，通过对25例临床呼吸道样本进行回顾性验证，确定了一种敏感而特异的mNGS方案，可用于自动化、泛病原体检测的病毒性疾病诊断。

实验结果

mNGS方案检测性能评估

(1)mNGS灵敏性

21份临床样本的多重qPCR检测结果表明：14例为1种病毒，6例为2种病毒，1例为3种病毒。基于以上结果，评估mNGS方案的临床敏感性。

mNGS评估结果：常规诊断检测到29个病毒中，mNGS检测到其中24个，对PCR靶标病毒的敏感性为83%。当以reads≥15为阈值时，灵敏度为66%(19/29),定义阳性结果与reads阈值相关。RNA病毒可能由于储存和冻融步骤而降解，导致mNGS的敏感性较低。mNGS靶标reads数与q-PCR的Cq值呈正相关，说明mNGS检测病毒具有定量性质。

(2)mNGS特异性

25份样本评估mNGS分析特异性，通过多重PCR检测，4个样本对15个靶标病毒全阴性；21个样本检测对12-14个靶标病毒呈阴性，个PCR结果阴性中有个结果与mNGS检测到的0reads病毒靶标一致。

mNGS评估结果：当考虑所有reads时，mNGS的特异性为94%，当以reads≥15为阈值时，特异性≥99%。

(3)mNGS检测到的特有病毒

除了qPCR检测的病毒病原体外，mNGS还检测到其它致病性病毒(丙型流感病毒、KI多瘤病毒、巨细胞病毒、肠病毒)，证明了该方法无偏倚性。

mNGS方案检测的其它结果

与多重PCR检测不同，mNGS在鉴定病毒的同时，可以进行分型和抗病毒药敏分析。

mNGS检测到副流感病毒4a亚型；甲型流感病毒H1N1；通过对基因序列分析提示病毒对奥司他韦、扎那米韦敏感。

结论

实验方法和生物信息学对mNGS检测病毒病原体的敏感性和特异性至关重要。本文建立并优化了mNGS病毒检测方案，可以在一次检测中检测出所有潜在的病原体，同时获得病毒的分型、抗病毒药物敏感性信息，可有效地应用于病毒学中的各种诊断分析，如无偏倚病毒检测、耐药突变、毒力标记和流行病学。

新冠疫情的发生向大众广泛普及了核酸检测的相关概念，使得公共卫生体系在全球获得极大重视，同时也让市场对基因检测相关技术提出了更高的要求：更快、更准、更便捷。宏基因组测序是最常用的分析微生物物种组成、基因功能的测序方法之一，在各个邻域都有广泛的应用，后续期望此技术的发展能为临床及科研带来更高的价值。

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